Home / CHUYÊN MÔN Y KHOA / Khoa Vi sinh Bệnh viện 19-8 triển khai kỹ thuật xét nghiệm gen XPERT và 1 số kết quả bước đầu

Khoa Vi sinh Bệnh viện 19-8 triển khai kỹ thuật xét nghiệm gen XPERT và 1 số kết quả bước đầu

  • ĐẶT VẤN ĐỀ
  • NỘI DUNG
  • KẾT LUẬN
Hiện nay tỉ lệ nhiễm lao được ước tính là 1/3 dân số thế giới, khoảng 9 triệu người mắc lao mới và hơn 3 triệu người chết do lao mỗi năm. Bệnh lao đang trở lên nghiêm trọng hơn với sự xuất hiện của các chủng lao đa kháng thuốc.

Theo báo cáo của WHO năm 2016, dịch tễ lao ở Việt Nam còn cao, xếp thứ 14  trong 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao nhất, xếp thứ 11 trong 27 nước có gánh nặng bệnh lao đa kháng thuốc trên toàn cầu. Song các chỉ số cơ bản đã cải thiện đáng kể. Như tỷ lệ lao mới các thể giảm từ 197 xuống 128/100.000 dân. Tỷ lệ tử vong giảm từ 36 xuống 17/100.000 dân [1].

Xpert MTB là một kỹ thuật sinh học phân tử mang tính đột phá trong chẩn đoán, trong 1 máy tích hợp 3 công nghệ (tách chiết gen tự động, PCR-nhân gen và Real time PCR để nhận biết gen), có kết quả sau 2h với độ chính xác cao [2].

Kết quả Xpert MTB cho biết có vi khuẩn lao và vi khuẩn lao có kháng với Rifamycine (RIF) không, qua đó chẩn đoán nhanh ca bệnh lao và lao đa kháng thuốc. Trên thế giới đã có một số nghiên cứu về giá trị của Gene Xpert trong chẩn đoán lao trên đối tượng lao đồng nhiễm HIV ở khu vực Châu Phi.

Tại Việt Nam mới có những nghiên cứu về giá trị của Xpert MTB/RIF trong nhóm nghi lao, lao kháng thuốc và lao trẻ em.

Tại Bệnh viện 19.8 đã triển khai Kĩ thuật xét nghiệm Gen Xpert tại Khoa Vi sinh nhằm phục vụ tốt hơn cho việc chẩn đoán và điều trị bệnh lao đặc biệt là trường hợp lao kháng thuốc.

1. Gene Xpert và Xpert MTB/RIF:

Với sự phát triển của công nghệ sinh học phân tử nói chung, các kỹ thuật
sinh học phân tử ứng dụng trong chẩn đoán lao có rất nhiều hứa hẹn, có thể phát hiện ra vật chất di truyền của một vài vi khuẩn trong điều kiện phòng xét nghiệm, điều này đặc biệt có ý nghĩa với các thể lao soi đờm trực tiếp âm tính, lao ở người nhiễm HIV, lao trẻ em, hoặc phát hiện sớm lao đa kháng thuốc.

Hiện nay, có một số kĩ thuật được sử trong chẩn đoán lao như: Phản ứng chuỗi PCR (polymerase chain reaction), Kỹ thuật LPA (Line-Probe Assay), Ngoài ra còn một số kĩ thuật khác đang trong giai đoạn thử nghiệm như: Kỹ thuật nhân bản đẳng nhiệt vòng trung gian và Kỹ thuật Oligonucleotide Microarray.

Phản ứng PCR: trong chẩn đoán vi khuẩn lao dựa trên việc phát hiện đoạn gen IS 6110. Trong điều kiện phòng xét nghiệm chỉ cần một lượng nhỏ vi khuẩn (1-3 vi khuẩn/1mm3 bệnh phẩm) đã cho kết quả dương tính. PCR không cho biết vi khuẩn còn sống hay đã chết. Tỷ lệ dương tính giả cao do lây nhiễm trong quy trình kỹ thuật. Âm tính giả có thể do sự có mặt của nhiều chất ức chế men nhân bản gen trong bệnh phẩm hoặc những vi khuẩn có dưới 6 đoạn IS 6110 hoặc không có đoạn này [5], Noordhoek (1994) tổng hợp kết quả từ 7 phòng xét nghiệm khác nhau, nhận xét độ nhạy của PCR trong chẩn đoán lao, dương tính giả cao từ 43%-77%, nguy cơ lây nhiễm chéo rất cao [8].

Kỹ thuật LPA: Kĩ thuật này dựa trên nguyên tắc lai ghép ngược đoạn DNA khuyếch đại từ chủng nuôi cấy hoặc bệnh phẩm với 10 đoạn dò (probe) phủ vùng nhân của gen rpoB của M. tuberculosis. Kĩ thuật này đã phát triển đến thế hệ thứ 2.

Thế hệ LPA thứ nhất, phát hiện tính kháng hay nhạy với RMP. Thế hệ LPA thứ hai, phát hiện kháng RMP và INH của vi khuẩn lao. Xác định được tính kháng của RMP qua các đột biến quan trọng của gen rpoB  (mã hoá cho tiểu phần β của RNA polymerase), kháng  INH ở mức độ cao độ  liên quan đột biến gen katG  (mã hoá cho enzyme catalase  – peroxidase), kháng INH ở mức độ thấp liên quan đột biến gen inhA. Lacoma và cộng sự (2008) nghiên cứu kỹ  thuật GenoType MTBDRplus cho thấy độ  nhạy phát hiện kháng RMP 98% (50/51), kháng INH 96,2% (49/51) [6].

 

Nguyễn Thu Hà (2013) nghiên cứu kỹ thuật Genotype MTBDRplus thấy xét nghiệm chẩn đoán kháng RMP độ nhạy, đặc hiệu lần lượt là  (Se  91,8%;  Sp  100%) cao hơn kháng  INH  (Se  88,5%;  Sp 93,8%), cao hơn đa kháng thuốc (Se 76,8%; Sp 100%) [3].

Tuy nhiên kĩ thuật LPA vẫn xuất hiện âm tính giả khi có yếu tố ức chế quá trình nhân bản trong bệnh phẩm, không có chứng nội tại, không phân biệt được DNA từ xác vi khuẩn ở bệnh nhân đang điều trị [13].

Ngoài những ưu điểm thì một số kĩ thuật sinh học phân tử trên cũng có một số hạn chế:  không xác định được vi khuẩn sống hay chết, dương tính giả và nguy cơ lây nhiễm chéo rất cao. Để khắc phục những hạn chế này, hiện nay các nhà khoa học đã nghiên cứu và đưa ra ứng dụng xét nghiệm Gene Xpert.

2. Chẩn đoán vi khuẩn lao bằng các kỹ thuật sinh học phân tử:

Xpert MTB/RIF (viết tắt là Xpert MTB) là một xét nghiệm sinh học phân tử phát hiện sự có mặt của vi khuẩn lao gây bệnh cho người cũng như đột biến kháng RMP bằng cách sử dụng 3 cặp mồi đặc hiệu và 5 đầu dò (probes) phân tử riêng biệt để đảm bảo độ đặc hiệu cao. Kỹ thuật cho kết quả nhanh chỉ trong vòng 2 giờ, khắc phục được tình trạng nhiễm chéo, sử dụng đơn giản, cho biết có vi khuẩn lao M.tuberculosis (MTB(+)) hay không có khuẩn lao M.tuberculosis  (MTB(-)), có kháng RMP  (RIF(+))  hay không kháng RMP (RIF(-)).

Cơ chế phát hiện vi khuẩn lao M.tuberculosis và kháng RMP

Trong DNA vi khuẩn lao, gen rpoB có kích thước 3519 bp, mã hóa cho tiểu phần β của RNA polymerase. Đột biến kháng RMP thường xảy ra trên đoạn gen rpoB, đặc biệt là ở đoạn nằm trung tâm của gen dài 81 bp được giới hạn từ bộ ba 507 đến 533 (vùng “nóng” – “hot-spot region”). Đột biến ở các vị trí khác nhau có mức độ kháng thuốc khác nhau. Đột biến tại vị trí bộ ba thứ 516, 526, 531, cho kết quả đề kháng với RMP cao; đột biến ở bộ ba 510, 515 và 512 kháng RMP ở mức độ thấp hơn. 45% các chủng có các đột biến mất ở codon 531 (S531) trong khi 35% các chủng kháng thuốc có sự thay đổi codon 526 (H526) dẫn đến thay thế acid amin [14], [7]. 90 – 97% các chủng M.tuberculosis kháng RMP được xác định là do các đột biến trên vùng gen ngắn 81 bp này của rpoB, còn 5 – 10% đột biến kháng RMP khác được xác định ở đoạn tận N hoặc ở vùng II của gen rpoB, hoặc liên quan tới có chế kháng thuốc khác. Xác định kháng RMP bằng phương pháp sinh học phân tử qua phát hiện đột biến gen rpoB có độ tin cậy cao hơn xác định đột biến trên gen katG gây kháng INH hoặc các thuốc khác [7]. Ngoài ra trên 85% đột biến trên  rpoB  kèm theo kháng INH, trong khi đó chỉ có 15% đột biến trên gen katG dẫn đến kháng đồng thời INH và RMP [7]. Chính vì lý do đó mà phát hiện đột biến gen rpoB được sử dụng trong kỹ thuật Gene Xpert nhằm phát hiện vi khuẩn lao M.tuberculosis và như một chỉ thị sớm phát hiện lao đa kháng thuốc [14], [7], [11].

Hình 1. A. Trình tự nucleotide ở vùng có tần suất đột biến cao trên gen rpoB; B. Quá trình gắn các đầu dò với các DNA đích và sự phát quang [7].

3. Một số kết quả xét nghiệm Gene Xpert ban đầu tại Khoa Vi sinh – Bệnh viện 19-8:

Khoa Vi sinh đã triển khai Kĩ thuật xét nghiệm Gene Xpert, Máy Gene Xpert và hóa chất được Chương trình chống lao Quốc gia cấp. Chúng tôi tiến hành xét nghiệm từ ngày 25/01/2018 đến tháng 3/2018 đã thu được một số kết quả (Bảng 1).

Bảng 1: Kết quả xét nghiệm Gene Xpert tại Khoa Vi sinh

Kết quả XpertMTB (-) Xpert MTB (+)/RIF (-) Xpert MTB (+)/RIF (+) Xpert MTB (+)/ không xác định kháng RIF Tổng số xét nghiệm
Số lượng 20 10 1 0 31
Tỉ lệ (%) 65% 32% 3% 0 100%

Ghi chú: VKL: Vi khuẩn lao; MTB: Mycobacterium tuberculosis; RIF: Rifampicin

Các mẫu đờm và dịch phế quản của những bệnh nhân nghi lao hoặc lao kháng thuốc được làm xét nghiệm Gene Xpert. Kết quả bảng 1 cho thấy, trong tổng số 31 xét nghiệm: phát hiện được 01 trường hợp lao dương tính kháng thuốc Rifampicin chiếm 3%; 10 trường hợp lao dương tính không kháng Rifampicin chiếm 32%; 20 trường hợp lao âm tính chiếm 65% và không phát hiện trường hợp lao dương tính không xác định kháng Rifampicin.

Mỗi xét nghiệm Gene Xpert sử dụng 3 cặp mồi đặc hiệu và 5 đầu dò (probe A, probe B, probe C, probe D, probe E) phân tử riêng biệt để đảm bảo độ đặc hiệu cao. Một số hình ảnh kết quả xét nghiệm trên máy Gene Xpert (Hình 2, hình 3, hình 4).

Bảng 2: Kết quả soi trực tiếp AFB và Xpert MTB

Kết quả AFB (+) AFB (-) Tổng số
Xpert MTB (+) 3 8 11
Xpert MTB (-) 0 20 20
Tổng 3 28 31

So sánh kết quả gene Xpert với kết quả xét nghiệm soi trực tiếp AFB (Bảng 2) cho thấy tổng 31 mẫu xét nghiệm Gene Xpert đồng thời xét nghiệm soi trực tiếp AFB thì tỉ lệ phát hiện vi khuẩn lao ở Xpert cao hơn hẳn là 35% (11/31) so với soi trực tiếp AFB 10% (3/31).  Độ nhạy (Se) của Xpert trong chẩn đoán lao phổi là 100% (3/3), độ đặc hiệu (Sp) là 71,4% (20/28). Tuy nhiên, kết quả xét nghiệm ban đầu của chúng tôi cũng khác với nghiên cứu của một số tác giả như:

Rachow (2011) nghiên cứu 292 bệnh nhân nghi lao, 172 trong số đó nhiễm HIV, độ nhạy của Xpert trong nhóm tỷ lệ soi âm, cấy dương Se 61,1%(11/16) [10].

O’Grady (2012) nghiên cứu phát hiện chủ động lao ở bệnh viện tuyến trung ương trên 937 đối tượng ở Nam Phi, thấy độ nhạy của Xpert MTB trong nhóm HIV dương tính Se 88,2% (142/161), độ đặc hiệu Sp 95,1% (235/247), tuy nhiên tỷ lệ soi trực tiếp dương tính trong nhóm này là 20,8%(85/408), độ nhạy của Xpert MTB trong nhóm soi âm Se 78,9% (60/76) [9].

Steingart KR (2014) phân tích gộp 27 nghiên cứu về giá trị của Xpert MTB/RIF, phân tích dưới nhóm HIV(+) độ nhạy Se 79%(95% CI 70-86%), nhóm soi trực tiếp âm tính, nuôi cấy dương tính, độ nhạy Se 61% (95% CI 40-81%) [11].

Tại Việt Nam, Mai Thanh Tú (2013) nghiên cứu trên 98 bệnh nhân nghi lao phổi đối tượng nghi lao và xét nghiệm dịch soi phế quản, nhận xét độ nhạy của xét nghiệm Gene Xpert Se 77,4%, độ đặc hiệu Sp 100% [12], Hoàng Hà (2014) nghiên cứu 151 bệnh nhân nghi lao, kết quả Gene Xpert có vi khuẩn lao chiếm 31,6% [4].

Một số kết quả xét nghiệm Xpert MTB ban đầu từ 25/1/2018 đến tháng 3/2018 tại Khoa Vi sinh cho thấy, trong tổng số 31 mẫu xét nghiệm Xpert MTB phát hiện được 01 trường hợp lao dương tính kháng thuốc Rifampicin chiếm 3%; 10 trường hợp lao dương tính không kháng Rifampicin chiếm 32%; 20 trường hợp lao âm tính chiếm 65% và không phát hiện trường hợp lao dương tính không xác định kháng Rifampicin.

So sánh kết quả gene Xpert với kết quả xét nghiệm soi trực tiếp AFB cho thấy tỉ lệ phát hiện vi khuẩn lao ở Xpert cao hơn hẳn là 35% (11/31) so với soi trực tiếp AFB 10% (3/31).

 

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyễn Kim Cương, Đinh Ngọc Sỹ, Nguyễn Viết Nhung (2015), “Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng, giá trị Gene Xpert MTB/RIF trong chẩn đoán lao phổi AFB (-) ở người nhiễm HIV”, Tạp chí Y học dự phòng, tập XXV, 10(170), 87-93.
2. Nguyễn Thị Kim Cương (2017), Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và giá trị kĩ thuật Gene Expert MTB/RIF trong chẩn đoán lao phổi AFB (-) ở người nhiễm HIV, Luận án tiến sĩ Y học, Đại học Y Hà Nội.
3. Nguyễn Thu Hà (2012), Nghiên cứu lâm sàng, cận lâm sàng, đột biến gen rpoB, katG và inhA của vi khuẩn trong lao phổi tái phát, Luận án tiến sỹ y học, Đại học Y Hà Nội.
4. Hoàng Hà (2014), Xét nghiệm Xpert MTB/RIF tại bệnh viện Lao và
Bệnh phổi Thái Nguyên năm 2014, Hội nghị Bệnh phổi toàn quốc lần thứ 6, Đà Nẵng.
5. Hale Y.M., Pfyffer G.E., Salfinger M. (2001), “Laboratory diagnosis
of mycobacterial infections: new tools and lessons learned”, Clin Infect
Dis,
33 (6), 834-846.
6. Lacoma A., Garcia-Sierra N., Prat   C. et al (2008), “GenoType MTBDRplus Assay for Molecular Detection of Rifampin and Isoniazid Resistance in Mycobacterium tuberculosis Strains and Clinical Samples”, Journal of Clinical Microbiology, 46 (11), 3660-3667.
7. Lawn S. D., Nicol M. P. (2011), Xpert MTB/RIF assay: “Development, evaluation and implementation of a new rapid molecular diagnostic for tuberculosis and rifampicin resistance”, Future Microbiology, 6 (9), 1067-1082.
8. Noordhoek G., Kolk A. et al (1994), Sensitivity and specificity of PCR for detection of Mycobacterium tuberculosis: a blind comparison study among seven laboratories. Journal of Clinical Microbiology, 32 (2).
9. O’Grady J., Bates M., Chilukutu L. et al (2012), Evaluation of the
Xpert MTB/RIF Assay at a Tertiary Care Referral Hospital in a
Setting Where Tuberculosis and HIV Infection Are Highly Endemic,
Clinical Infectious Diseases, 55 (9), 1171-1178.
10. Rachow A., Zumla A., Heinrich N. et al (2011), Rapid and accurate
detection of Mycobacterium tuberculosis in sputum samples by
Cepheid Xpert MTB/RIF assay-a clinical validation study, PLoS One,6 (6), e20458.
11. Steingart K. R., Schiller I., Horne   D. J. et al (2014), Xpert(R) MTB/RIF assay for pulmonary tuberculosis and rifampicin resistance in adults, Cochrane Database Syst Rev, (1), CD009593.
12. Mai Thanh Tú (2013), Kết quả Xpert MTB/RIF trong dịch soi phế
quản bệnh nhân nghi lao
, Luận văn Thạc sỹ Y học, Đại học Y Hà Nội.
13. Viveiros M., Leandro C., Rodrigues L. et al (2005), “Direct Application of the INNO-LiPA Rif.TB Line-Probe Assay for Rapid Identification of Mycobacterium tuberculosis Complex Strains and Detection of Rifampin Resistance in 360 Smear-Positive Respiratory Specimens from an Area of High Incidence of Multidrug-Resistant Tuberculosis”, Journal of Clinical Microbiology, 43 (9), 4880-4884.
14. WHO (2014), Xpert MTB/RIF implementation manual, Switzerland.

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *